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The Chinese Livestock and Poultry Breeding >

2026 , Vol. 22 >Issue 5: 32 - 42

DOI: https://doi.org/10.19543/j.cnki.1673-4556.20260416.001

Biotechnology

Tissue expression and differentiation characteristics of genes regulating muscle fiber types in Xinyang buffalo

  • Xiaoge Zhang , 1 ,
  • Yanduo Zhou 2 ,
  • Jianzhang Li 1 ,
  • Luping Ma 1 ,
  • Jun Li 1 ,
  • Ruijie Hao 3 ,
  • Zijing Zhang 4 ,
  • Yun Ma 5 ,
  • Tianliu Zhang 6 ,
  • Chengcheng Liang , 1
Expand
  • 1. College of Animal Science and Technology, Xinyang Agricultural and Forestry University, Xinyang, 464000, Henan
  • 2. College of Agronomy, Xinyang Agricultural and Forestry University, Xinyang, 464000, Henan
  • 3. College of Life Sciences, Xinyang Normal University, Xinyang, 464000, Henan
  • 4. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou, 450000, Henan
  • 5. College of Animal Science and Technology, Ningxia University, Yinchuan, 750000, Ningxia
  • 6. College of Animal Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou, 450000, Henan

Received date: 2025-11-26

  Online published: 2026-06-17

Fold

Abstract

Objective To elucidate the functions of MSTN, BDNF, and DKK3 genes associated with slow-to-fast muscle fiber conversion in Xinyang buffalo and their effects on meat quality characteristics, in order to provide reference for the improvement of Xinyang buffalo breeds. Method Three muscle fiber-related genes (MSTN, BDNF, DKK3) were selected from relevant literature. Their amino acid sequences were downloaded from NCBI, domain prediction was performed using MEME, and protein interaction analysis was conducted through the online software STRING for bioinformatics evaluation. Tissue samples from three 36-month-old bulls (Liver, spleen, lung, kidney, heart, foreleg muscle, hindleg muscle, longissimus dorsi muscle, subcutaneous muscle, large intestine, small intestine) were collected for tissue expression profiling. Collect the longissimus dorsi muscle from a 1-day-old newborn calf, isolate and culture the primary cells, induce their differentiation, and analyze time-course gene expression. Result Bioinformatics analysis reveals that the protein encoded by the MSTN gene contains domains associated with the TGF-β signaling pathway and is predominantly highly expressed in skeletal muscle tissue. The protein encoded by the BDNF gene possesses domains related to neurotrophic factors and is primarily highly expressed in neural tissues and skeletal muscle. The protein encoded by the DKK3 gene contains domains associated with the Wnt signaling pathway and is mainly highly expressed in adipose and liver tissues. GO and KEGG analyses further indicated that these genes were respectively enriched in the TGF-β signaling pathway, neurotrophic factor signaling pathway, and Wnt signaling pathway. The temporal differentiation results showed that the expression of MSTN was upregulated in the early stage of differentiation and then rapidly downregulated; the expression level of the BDNF gene exhibited a gradual upward trend and was reactivated and upregulated at the late differentiation stage; DKK3 was not expressed during the differentiation of primary myoblasts. Conclusion These results indicate that the expression of MSTN, BDNF, and DKK3 genes is associated with the formation of muscle fibers in buffalo.

Key words： Xinyang buffalo; MSTN; BDNF; DKK3; Bioinformatics analysis; Tissue expression

Cite this article

Xiaoge Zhang , Yanduo Zhou , Jianzhang Li , Luping Ma , Jun Li , Ruijie Hao , Zijing Zhang , Yun Ma , Tianliu Zhang , Chengcheng Liang . Tissue expression and differentiation characteristics of genes regulating muscle fiber types in Xinyang buffalo[J]. The Chinese Livestock and Poultry Breeding, 2026 , 22(5) : 32 -42 . DOI: 10.19543/j.cnki.1673-4556.20260416.001

水牛是亚洲地区重要的家畜，中国水牛存栏量位居世界第三，仅次于印度和巴基斯坦[1]。水牛肉因其独特风味和营养价值受到广泛欢迎，其脂肪含量低，尤其是饱和脂肪远低于其他肉类，契合了当下的健康饮食趋势。同时，由于其本身具有较高的水分，且肉的肌纤维较粗，烹饪后肉质会更为多汁，进一步提升了食用口感。此外，与其他肉类相比，水牛肉的抗氧化性较强，富含铁和锌等微量元素，对人类身体健康有益[2]。因此，水牛肉在传统和现代健康饮食市场中受到重视。
信阳水牛主产于河南省信阳市，周边地区南阳、驻马店、安徽的六安、湖北的广水等地也有少量分布，是我国优良的地方水牛品种。其以体型大、骨骼粗壮、结实、繁殖力强、耐湿热、耐粗饲、性情温顺、抗病力强、役用能力强、早期生长发育快、产肉性能良好等优良特性而闻名于省内外，是产区内的优势畜种[3]。水牛在不同生长阶段的肌肉发育较为均衡，具有较强的环境适应性，无论是在草原、山区或湿地等不同气候条件下，其肌肉都能够保持较高的生长速度和肉质水平[4,5]。此外，水牛的肌肉发育和脂肪分布更具协调性，这使得水牛肉在食用时更为健康，脂肪含量适中，既能保持肉质的细腻感，又能满足现代消费者对低脂高蛋白饮食的需求。而其特有的风味及高品质则体现在水牛的肌肉组织中。
水牛的肌肉类型包括快肌纤维（Ⅱ型纤维）和较高比例的慢肌纤维（I型纤维）。快肌纤维主导的肌肉具有较强的收缩能力，纤维糖酵解能力强，肌纤维直径较细，脂肪沉积潜力更大，因此水牛的肉质嫩度更高，口感更加紧实，且富有嚼劲[6]；而慢肌纤维主导的肌肉具有较多的结缔组织，高含量的肌红蛋白，同时脂肪含量低等特性赋予了水牛肉更为丰富的风味。信阳水牛背最长肌慢肌纤维比例高，导致水牛肉在嫩度上欠佳，肌纤维也较粗，对口感有一定影响。有研究表明，慢肌纤维可以在一定情况下向快肌纤维转化，如MSTN、BDNF及DKK3[7]。因此研究由慢肌纤维向快肌纤维转化的肌肉因子，可为后续研究信阳水牛肌纤维转化提供依据。
肌肉生长抑制因子（Myostat-in, MSTN）基因是一种负调控因子，主要参与肌肉的生长调控。MSTN基因通过抑制肌肉的增生和分化，从而控制肌肉量的大小和生长速度[8]。它的作用机制为抑制肌肉前体细胞的增殖和分化，进而影响肌肉的体积和重量。在多种物种中，包括猪、牛、羊等，MSTN基因的突变或功能丧失会导致“肌肉多”的现象，即肌肉生长异常快速，肌肉体积增大，常常表现为肌肉量显著增加[9]。这一特性使得MSTN基因成为肉类生产中重要的研究对象。科学家们通过对MSTN基因的深入研究，发现其不仅影响肌肉数量，还与脂肪沉积、骨骼发育等多个生理过程密切相关[10]。王鑫等[11]研究发现，在利用西门塔尔与鲁西牛的杂交试验中，约20月龄的育肥西鲁杂交牛屠宰率可达60.5%～60.96%，而利用MSTN基因编辑F1代杂交牛的胴体重和屠宰率不仅明显高于纯系鲁西牛，也高于中国西门塔尔牛，且对牛肉的pH值、嫩度、脂肪酸组成等指标几乎不产生影响。因此，MSTN基因不仅是理解肌肉发育机制的关键，也是推动肉类产量提升、改良动物育种的潜力基因。
脑源性神经营养因子基因（Brain-derived neurotrophic factor, BDNF）是一种运动诱导的非特异性肌肉因子，主要编码神经生长因子蛋白质家族的成员。在发育过程中，BDNF促进外周和中枢神经系统选定神经元群的存活和分化，参与轴突生长、寻路以及树突生长和形态的调节[12]。另有研究发现，BDNF或可通过AMPK-PGC1α信号通路调控骨骼肌的功能[13]。同时还发现，肌源性BDNF可通过调控肌肉功能来改善肯尼迪病小鼠的运动特性，但其改善效果在不同肌纤维类型之间存在差异，肌肉收缩力量只在快肌纤维中得到改善，突触传递能力只在慢肌纤维中得到改善[14]。
Dickkopf相关蛋白3（Dickkopf-3，DKK3）是属于DKK蛋白家族的一种分泌型糖蛋白，通过调节Wnt信号转导途径发挥作用，是Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂。郭进磊[15]研究发现，DKK3基因多态性与南阳牛经济性状之间存在显著关联。张凤等[16]研究发现，在非酒精性脂肪肝患者和肥胖小鼠的肝脏组织中以及体外培养的经棕榈酸刺激的肝脏细胞中，DKK3的表达量都显著降低；此外，通过在肝脏细胞中过表达和抑制表达DKK3，证实DKK3可能通过抑制凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）活性阻碍下游p38/JNK通路激活的方式抑制肥胖、胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性。同时，肌纤维类型分布及其转化与衰老及肥胖过程密切相关。在衰老状态下，快肌纤维特异性增加与DKK3的表达相关[17]。
目前MSTN、BDNF、DKK3基因在畜禽肌肉发育及肌纤维转化中的作用已得到初步证实，但相关研究多集中于普通黄牛及模式动物，在信阳水牛中尚未开展系统研究，其基因序列特征、组织表达规律及对肌纤维类型转化的调控机制尚不明确。信阳水牛存在慢肌纤维比例高、肌纤维较粗、嫩度不佳等肉质问题。因此，本研究以信阳水牛为研究对象，围绕 MSTN、BDNF、DKK3 基因开展生物信息学分析与组织表达检测，明确其与肌纤维特性及肉质性状的关联，为后续水牛肉质改良研究提供参考。
本研究通过对信阳水牛的MSTN、BDNF和DKK3基因进行生物信息学分析，并检测其在信阳水牛各组织中的表达差异，通过MSTN、BDNF和DKK3基因的蛋白互作网络，检测其在不同组织中的功能，探讨其与水牛肉质特性之间的关联，以期能够筛选出与水牛肉质相关的关键基因，为水牛的品种改良和基因选择育种提供分子标记。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所需组织样品来自河南信阳某水牛养殖场，样品采集时间为2025年1月，采集样本为3头健康状态、体况一致的36月龄公牛的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、心脏、前腿肌、后腿肌、背最长肌、皮下肌、大肠、小肠等11种组织，无菌采集后迅速投入液氮送至实验室于-80 ℃冰箱保存，原代成肌细胞由新生1日龄信阳水牛犊牛背最长肌分离获得。所有动物样品的采集、分离操作均经信阳农林学院实验动物福利伦理审查委员会批准，严格遵循《信阳农林学院实验动物福利伦理审查委员会章程》及动物福利相关原则开展试验。

1.2 主要试剂

RNase抑制剂、Ⅰ型胶原酶、DMEM/F12、青霉素-链霉素混合液、胰蛋白酶，马血清购于武汉塞维尔生物科技有限公司；总RNA提取试剂RNAiso Plus，反转录试剂盒（PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser）购于Takara公司，荧光定量PCR试剂盒（SGExcel FastSYBR Master）购于生工生物工程有限公司，胎牛血清购于德国PAN公司。

1.3 原代成肌细胞分离培养与诱导分化

无菌采集1头1日龄信阳水牛背最长肌，采用组织消化法进行原代成肌细胞的分离，首先采集保存在含有5%双抗的PBS中，细胞间超净工作台去除筋膜后剪碎，Ⅰ型胶原酶37 ℃消化2 h，过细胞筛后，按照密度进行铺板，放于CO2培养箱进行培养，按照完全培养基（84% DMEM/F12+15% FBS+1%青霉素-链霉素混合液）进行培养，细胞接触抑制后，更换分化培养基（97% F12+2% HS+1%双抗）诱导分化。在分化的第0、2、4、6、8天收集提取RNA并检测相关基因的表达。

1.4 总RNA提取和反转录

用Trizol法提取信阳水牛各组织及细胞RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带，通过超微量分光光度计检测OD260/OD280比值来检测总RNA的浓度及质量。将质量符合要求的总RNA用反转录试剂盒（PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser）进行反转录，cDNA保存于-20 ℃冰箱，以后用于荧光定量PCR，以上操作过程均在冰上操作，严格去除RNase，防止RNA降解，影响实验结果。

1.5 引物设计与合成

根据NCBI官网公布的各基因mRNA序列。设计特异性引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列相关信息见表1。
表1 MSTN、BDNF及DKK3基因的引物信息

Table 1 Primer information of MSTN, BDNF and DKK3 genes

基因Genes 引物序列（5'-3'）Primer sequence 产物长度Product length/bp 退火温度Annealing temperature/℃
MSTN-F CATTACCATGCCCACGGAGTCTG 149 63.6
MSTN-R TCGCAGGAGTCTTGACAGGTCTC
BDNF-F AACTCCCAGTGCCGAACTACCC 80 64.1
BDNF-R ATGAACCGCCAGCCAATACGC
DKK3-F TCGTCCTCTCGGCAGTGTTACTC 148 63.6
DKK3-R ACTCGGGCAAGCAAGATGACATC
β- actin-F CATCCTGACCCTCAAGTA 91 52.3
β -actin-R CTCGTTGTAGAAGGTGTG

1.6 PCR扩增

分别以1.3中cDNA作为模板，用PCR酶SG Excel Fast SYBR Master Mix扩增，PCR反应体系20 µL：2X SG Excel Fast SYBR Mixture 12.5 µL，上游引物0.4 µL，下游引物0.4 µL, Template cDNA 2.0 µL，DEPC 9.7 µL。qRT-PCR反应程序为95 ℃变性5 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸12 s，35个循环。每个样品重复3次，以β-actin为内参基因[18]。

1.7 基因分子结构与功能预测

对信阳水牛MSTN、BDNF和DKK3基因的mRNA序列进行序列分析，利用在线软件（https://web.expasy.org/protparam/)进行蛋白质的一级结构分析，利用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）下载其氨基酸序列，利用MEME（meme-suite.org/meme/index.html）进行结构域预测。利用在线软件STRING（https://string-db.org）分析蛋白互作情况。

1.8 蛋白互作网络分析及富集分析

利用STRING数据库（https://cn.string-db.org/）对信阳水牛MSTN、BDNF和DKK3的蛋白进行互作网络分析，采用数据库默认参数。为进一步明确互作网络中蛋白的功能，利用STRING数据库内置的GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析工具进行功能注释和通路分析，统计方法采用超几何检验，以FDR（False discovery rate）<0.05作为显著性阈值。

1.9 数据处理

用 2 - ∆ ∆ C t法计算各基因相对表达量，结果用“平均值±标准差”表示，使用SPSS 18.0（Duncan）进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 分子结构与蛋白一级结构分析

MSTN基因登录号NM_001290967，mRNA全长1231 bp，包含3个外显子，CDS区全长1128 bp，共编码375个氨基酸。其中Leu和Lys含量最高，分别为9.9%和6.9%，蛋白质等电点（pI）为6.05，属于酸性氨基酸。蛋白分子式为C1894H2989N507O560S21，蛋白质分子量42.5 kDa，蛋白质中负电荷残基（Asp+Glu）为48，正电荷残基（Arg+Lys）为45，该蛋白整体带负电荷；BDNF基因登录号XM_044929322，mRNA全长1419 bp，包含1个外显子，CDS区全长777 bp，共编码258个氨基酸。其中Ser和Arg含量最高，分别为8.9%和8.1%，蛋白质等电点（pI）为9.21，属于碱性氨基酸。蛋白分子式为C1269H2045N367O384S20，蛋白质分子量29.2 kDa，蛋白质中负电荷残基（Asp+Glu）为29，正电荷残基（Arg+Lys）为38，该蛋白整体带正电荷；DKK3基因登录号XM_006055228，mRNA全长2583 bp，包含1个外显子，CDS区全长1050 bp，共编码349个氨基酸。主要为Glu（12.6%）和Leu（9.7%），蛋白质等电点（pI）为4.50，属于酸性氨基酸。蛋白分子式为C1635H2574N456O550S29，蛋白质分子量38.3 kDa。

2.2 Motif及结构域分析

通过对MSTN、BDNF及DKK3的氨基酸序列进行分析，结果如图1和2所示，发现MSTN编码区存在3个motif，分别位于第138～143位（CCFFQR）、第156～166位（QLWIYFRPTKT）及第294～299位（FGWDWI）。共含有2个结构域，分别为位于43～254位氨基酸的TGFb_propeptide（前肽区，CDD编号: cl46657）和位于269～376位氨基酸的TGF_beta_GDF8（CDD编号: cd19388）；BDNF编码区存在2个motif，分别位于第190～200位（QLWIYFRPTKT）及第239～244位（FGWDWI）。共含有1个结构域，为位于147～253位氨基酸的NGF（神经生长因子家族，SMART编号：smart-00140）；DKK3编码区存在2个moif，分别位于第189～199位（QLWIYFRPTKT）及第220～225位（CCFFQR）。共含有2个结构域，分别位于41～197位氨基酸的Dkk3_N_Cys1（CDD编号：cd23014）和第200～286位氨基酸的Dkk3_Cys2（CDD编号：cd23274）。
图1 基于MSTN、BDNF及DKK3基因的氨基酸序列motif分析

Fig. 1 Motif analysis based on the amino acid sequences of MSTN， BDNF， and DKK3 genes

图2 基于MSTN、BDNF及DKK3基因的氨基酸序列结构域分析

Fig. 2 Domain analysis based on the amino acid sequences of MSTN， BDNF， and DKK3 genes

2.3 蛋白互作网络分析

图3是用STRING网站做的预测图，由图3a可以看出，该网络图中共有11个节点，40条边，平均节点度为7.27。包括主要成员MYOG、MYF5、MYOD1、SMAD2和FST等。由图3b可以看出，该网络图中共有11个节点，44条边，平均节点度为8.00。包括主要成员NGF、GDNF、GFAP、NTF4和IL6等。由图3c可以看出，该网络图中共有11个节点，51条边，平均节点度为9.27，包括主要成员DKK1、DKK2、LRP5、SFRP1、SFRP2和SFR-P4等。
图3 MSTN、BDNF、DKK3蛋白互作预测结构图

Fig. 3 Protein-protein interaction prediction structure of MSTN， BDNF， and DKK3

2.4 GO及KEGG富集分析

通过使用KEGG富集分析统计方法，来确定一组基因或蛋白质在KEGG通路数据库中显著富集的通路。由表2可知，MSTN主要集中在TGF-β信号通路、调控干细胞多能性的信号通路及细胞因子-细胞因子受体相互作用。BDNF主要富集在神经营养因子信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路及细胞因子-细胞因子受体相互作用。DKK3主要富集在Wnt信号通路。
表2 蛋白互作网络KEGG富集分析

Table 2 Protein interaction network KEGG enrichment analysis

核心蛋白

Core protein

通路ID

Term ID

通路描述

Term description

基因数量

Gene count

错误率

FDR

基因

Genes
MSTN bta04350 TGF-β信号通路 6 7.56E-10 FST, SMAD2, TGFBR1, ACVR2A, ACVR1B, ACVR2B
bta04550 调节干细胞多能性 5 6.67E-07 SMAD2, ACVR2A, MYF5, ACVR1B, ACVR2B
bta04060 细胞因子-受体相互作用 5 1.62E-05 MSTN, TGFBR1, ACVR2A, ACVR1B, ACVR2B
BDNF bta04722 神经营养因子 6 2.24E-09 BDNF, NGFR, NTRK2, NTF4, NGF, SORT1
bta04151 PI3K-Akt信号通路 6 9.36E-07 BDNF, IL6, NGFR, NTRK2, NTF4, NGF
bta04014 Ras信号通路 5 5.85E-06 BDNF, NGFR, NTRK2, NTF4, NGF
bta04010 MAPK信号通路 5 1.03E-05 BDNF, NGFR, NTRK2, NTF4, NGF
DKK3 bta04310 Wnt信号通路 7 6.33E-11 LRP5, DKK2, SFRP4, CTNNB1, SFRP2, SFRP1, DKK1
表3是互作网络图中基因的GO富集分析结果，包括细胞组分（Cellular component, CC）分子功能（Molecular function, MF）和生物学过程（Biological process, BP）。通过对蛋白互作网络中的基因进行GO富集分析，能够确定在这些蛋白中显著富集的GO术语，从而了解它们主要参与的生物学功能和过程。分别取各类别中的FDR前5进行展示。互作网络图中基因的GO富集分析中的细胞组分中，MSTN基因主要富集集中于激活素受体复合体（Activin receptor complex），BDNF基因主要富集集中于质膜界定的细胞突起（Plasma membrane bounded cell projection），DKK3基因主要富集集中于细胞外区域（Extracellular region）。互作网络图中基因的GO富集分析中的分子功能中，MSTN基因主要富集到激活素受体复合体（Activin receptor complex），BDNF基因主要富集到激活素受体活性（Activin receptor activity），DKK3基因主要富集到Wnt蛋白结合（Wnt-protein binding）及信号受体调节活性（Signaling receptor regulator activity）等。互作网络图中基因的GO富集分析中的生物学过程中，MSTN基因主要富集到激活素受体信号通路的调控（Regulation of activin receptor signaling pathway），跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路（Transmembrane receptor protein serine/threonine kinase signaling pathway）和细胞分化调控（Regu-lation of cell differentiation），BDNF基因主要富集到神经营养因子信号通路（Neurotrophin signaling pathway），DKK3基因主要富集到典型Wnt信号通路的负调控（Negative regulation of canonical Wnt signaling pathway），和细胞分化的正调控（Positive regulation of cell differentiation）等。
表3 蛋白互作网络GO富集分析

Table 3 Protein interaction network GO enrichment analysis

项目

Items

基因

Genes

项目ID

Term ID

项目描述

Term description

基因数量

Gene count

 错误率FDR

基因

Genes

细胞组分

Cellular component

 MSTN GO: 0048179 激活素受体复合体 4 1.99E-08 TGFBR1, ACVR2A, ACVR1B, ACVR2B
BDNF GO: 0045202 突触 5 0.0174 BDNF, NGFR, NTRK2, NTF4, NGF
GO: 0120025 质膜界定的细胞突起 6 0.0174 CNTF, BDNF, NTRK2, NTF4, NGF, GFAP
DKK3 GO: 0005576 细胞外区域 8 0.0014 DKK3, FRZB, DKK2, WIF1, SFRP4, SFRP2, SFRP1, DKK1

分子功能

Molecular function

 MSTN GO: 0048179 激活素受体复合体 4 1.99E-08 TGFBR1, ACVR2A, ACVR1B, ACVR2B
GO: 0048185 激活素结合 6 2.20E-13 FST, TGFBR1, ACVR2A, ACVR1B, FSTL3, ACVR2B
BDNF GO: 0017002 激活素受体活性 4 4.83E-08 TGFBR1, ACVR2A, ACVR1B, ACVR2B
DKK3 GO: 0017147 Wnt蛋白结合 5 1.02E-08 LRP5, FRZB, SFRP4, SFRP2, SFRP1
GO: 0005102 信号受体结合 6 0.0105 DKK3, DKK2, WIF1, SFRP2, SFRP1, DKK1
GO: 0005515 蛋白质结合 10 0.021 DKK3, LRP5, FRZB, DKK2, WIF1, SFRP4, CTNNB1, SFRP2, SFRP1, DKK1
GO: 0030545 信号受体调节活性 4 0.0462 DKK3, DKK2, SFRP2, DKK1
GO:0017147 Wnt蛋白结合 5 1.02E-08 LRP5, FRZB, SFRP4, SFRP2, SFRP1
生物学过程Biological process MSTN GO: 0032925 激活素受体信号通路的调控 5 6.04E-09 FST, SMAD2, ACVR2A, ACVR1B, FSTL3
GO: 0007178 跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路 7 7.99E-09 FST, MSTN, SMAD2, TGFBR1, ACVR2A, ACVR1B, ACVR2B
GO: 0045595 细胞分化调控 10 7.99E-09 MYOD1, FST, MYOG, MSTN, SMAD2, TGFBR1, ACVR2A, MYF5, ACVR1B, FSTL3
BDNF GO: 0038179 神经营养因子信号通路 5 4.78E-09 BDNF, NTRK2, NTF4, NGF, SORT1
DKK3 GO: 0090090 典型Wnt信号通路的负调控 9 4.90E-15 DKK3, FRZB, DKK2, SFRP4, CTNNB1, KREMEN1, SFRP2, SFRP1, DKK1
GO: 0045597 细胞分化的正调控 7 4.31E-06 LRP5, FRZB, WIF1, SFRP4, CTNNB1, SFRP2, SFRP1

2.5 信阳水牛MSTN、BDNF及DKK3基因组织表达谱分析

分别用液氮研磨结合Trizol法提取信阳水牛11种组织的总RNA，之后进行琼脂糖凝胶电泳以及超微量分光光度计检测OD260/OD280比值检测RNA质量。电泳结果有3条带，其中28S和18S条带很亮，5S条带很暗；OD260/OD280比值均在2.0～2.2。说明RNA完整性良好，无明显降解，可以进行反转录以及后续试验。反转录之后的cDNA保存于-20 ℃。
由图4a可知，MSTN基因在背最长肌中表达最高，显著高于其他组织（P＜0.05），在内脏器官（肝脏、脾脏、肺脏、肾脏）以及小肠、大肠中表达量差异不显著（P＞0.05）。由图4b可知，BDNF基因在肺脏表达最高，显著高于其他组织（P＜0.05），在内脏组织（心脏、脾脏）表达量差异不显著（P＞0.05）。由图4c可知，DKK3基因主要在肺脏表达量最高，显著高于其他组织（P＜0.05），在肌肉组织（皮下肌、前腿肌、后腿肌、背最长肌）以及内脏组织（肝脏、脾脏）、大肠、小肠中表达量差异不显著（P＞0.05）。
图4 MSTN、BDNF、DKK3基因在信阳水牛成年牛11种组织中的相对表达情况

注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。

Fig. 4 Relative expression of MSTN，BDNF，and DKK3 genes in 11 tissues of adult Xinyang buffalo

Note: Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05), and different uppercase letters indicate highly signifi-cant differences (P < 0.01).

2.6 信阳水牛MSTN、BDNF及DKK3基因在原代成肌细胞分化过程中的表达情况

为探究MSTN、BDNF及DKK3基因在肌肉细胞分化过程中的时序表达模式，本实验从1日龄信阳水牛犊牛背最长肌分离培养原代成肌细胞，并诱导其成肌分化。通过qRT-PCR检测MSTN、BDNF及DKK3基因在牛背最长肌肌肉细胞分化0、2、4、6和8天的表达量。图5a显示，MSTN基因在诱导分化的第2天相对表达量最高，显著高于其他时段（P<0.05），在第6～8天的相对表达量差异不显著（P＞0.05）。图5b显示，BDNF基因在诱导分化的过程中呈整体上升的趋势，诱导分化的第8天相对表达量最高，显著高于其他时段（P<0.05）其中分化第4～6天的相对表达量差异不显著（P＞0.05）。DKK3基因在原代成肌细胞诱导分化过程中不表达。
图5 MSTN、BDNF在信阳水牛原代成肌细胞诱导分化过程中的相对表达

Fig. 5 Relative expression of MSTN and BDNF in the differentiation of primary skeletal muscle cells from Xinyang buffalo

3 讨论

MSTN基因编码的蛋白质属于TGF-β超家族成员，其分子结构分析显示，该蛋白含有2个关键结构域：TGFb_propeptide（前肽区）和TGF_beta_GDF8（GDF8结构域）。这2个结构域的存在表明MSTN基因在肌肉生长调控中具有重要作用。通过蛋白互作网络分析，发现MSTN与MYOG、MYF5和MYOD1等肌肉分化相关蛋白具有显著关联，进一步支持了MSTN基因在肌肉发育中的关键作用。曾建红等[19]研究显示，MSTN与MYOG协同作用，可通过影响肌肉纤维的数量来促进肌肉的增长以及快肌的分化比例。杨漫漫[20]研究表明，MSTN和MYOG共同影响黄牛的体尺数据，促进MYOG表达的同时，抑制MSTN的表达，可使黄牛的体尺数据优于普通表达（MSTN正常表达）时的体尺数据。MYF5作为生肌调节因子家族的成员，其与MSTN、MYOG在调节动物胚胎期肌肉形成过程中呈拮抗作用[21,22]。MyoD1基因在骨骼肌的生长中起正向调节作用，其表达水平与肌原细胞分化能力正相关，且可使非成肌细胞转化为肌细胞[23]；而MSTN作为骨骼肌生长的负向调节因子，二者之间相互调控、相互影响[24]。此外，GO和KEGG分析显示，MSTN基因主要富集于TGF-β信号通路、干细胞多能性调控以及细胞分化过程，这与其在肌肉生长和肉质特性中的作用密切相关。组织表达分析表明，MSTN基因在背最长肌、后腿肌和皮下肌等骨骼肌组织中表达较高，而在内脏器官和消化道组织中基本不表达。这表明MSTN基因在肌肉组织中具有较高的表达特异性，可能与肌肉生长和肉质特性密切相关。这种表达特异性提示MSTN基因可能通过调控肌肉细胞的增殖和分化，影响水牛肉质的嫩度和风味。时序分化结果表明在犊牛出生后短时间内，MSTN会出现一次短暂的上调，随后快速下调。这一结果揭示了MSTN在初生犊牛背最长肌肌肉细胞分化过程中的表达规律，早期上调以抑制过快的肌纤维增殖，随后下调以促进肌肉肥大[25]。
BDNF基因编码的蛋白质属于神经生长因子家族成员，其分子结构分析显示，该蛋白质含有一个NGF结构域，这表明其在神经元存活和分化中的重要作用。蛋白互作网络分析显示，BDNF与NGF、GDNF和IL6等神经营养因子相关蛋白具有显著关联，进一步支持了其在神经功能中的作用。易康乐[26]研究表明，BDNF与NGF协同合作，可促进牛颗粒细胞的体外生长。同时，方芳[27]研究发现，BDNF和NGF都可促进神经嵴来源的感觉神经元与胆碱神经元的存活。另有研究发现小鼠体内的GDNF感应周围神经损伤后，可激活并表达BDNF，从而促进神经损伤修复[28]。刘琼[29]研究显示，GDNF可促进神经干细胞的增殖，而BDNF和GDNF对干细胞的分化具有潜在的促进作用。GO和KEGG分析表明，BDNF基因主要富集于神经营养因子信号通路、PI3K-Akt信号通路以及MAPK信号通路，这与其在神经元功能和肌肉代谢中的作用密切相关。组织表达分析表明，BDNF基因在肺脏和肾脏等神经相关组织中表达较高，而在骨骼肌组织中也有显著表达。这可能与其在神经元功能和肌肉发育中的作用有关，这种表达模式提示BDNF基因可能通过调控神经信号通路和肌肉代谢，影响水牛肉质的风味和嫩度。时序分化结果表明BDNF在初生犊牛背最长肌肌肉细胞分化过程中的表达规律：在犊牛出生后，BDNF基因表达量呈逐渐上升的趋势，并达到峰值[30]。
DKK3基因编码的蛋白质属于分泌型糖蛋白，其分子结构分析显示，该蛋白含有2个关键结构域：Dkk3_N_Cys1和Dkk3_Cys2。这2个结构域的存在表明DKK3基因在Wnt信号通路调控中具有重要作用。蛋白互作网络分析显示，DKK3与DKK1、DKK2、LRP5和SFRP1等Wnt信号通路相关蛋白具有显著关联，进一步支持了其在脂肪代谢和肝脏健康中的作用。DKK3与DKK1在Wnt信号通路中具有拮抗作用。在骨代谢方面，DKK1能够抑制成骨细胞分化并促进破骨细胞活性，导致骨质流失。相反，DKK3可对骨代谢产生保护作用[31]。尽管DKK3不直接与LRP5结合，但是其可通过干扰Kremen1/2的稳定性来间接影响LRP5的膜定位及活性，最终影响LRP5的功能[32]。在某些情况下，DKK3可能通过竞争性抑制DKK1和LRP5的结合，从而间接调节Wnt信号通路。Wnt信号通路在细胞增殖、分化以及组织发育等多种生物过程中起重要作用[33]。DKK3和SFRP1可通过影响相关细胞的增殖和分化间接影响肌肉生长或组织发育[34]。DKK3与GO和KEGG分析表明，DKK3基因主要富集于Wnt信号通路、脂肪变性和胰岛素抵抗相关过程，这与其在脂肪代谢和肝脏功能中的作用密切相关。组织表达分析表明，DKK3基因在皮下肌、肝脏和脾脏等脂肪和肝脏组织中表达较高，而在骨骼肌组织中也有一定表达。这种表达模式提示DKK3基因可能通过调控脂肪沉积和肝脏代谢，影响水牛肉质的脂肪含量和健康特性。时序分化结果表明水牛在出生后前几天的肌肉分化尚未进入DKK3依赖的阶段，初生期Wnt信号需保持活跃，DKK3被转录抑制以避免过早抑制肌肉增殖，可能出现暂时性低表达[35]。
本研究发现，MSTN、BDNF和DKK3基因在信阳水牛不同组织中的表达特异性与其生物学功能密切相关。MSTN基因在骨骼肌中的高表达表明其可能通过调控肌肉细胞的增殖和分化，影响水牛肉质的嫩度和风味。BDNF基因在神经相关组织和骨骼肌中的高表达表明其可能通过调控神经信号通路和肌肉代谢，影响水牛肉质的风味和嫩度。DKK3基因在脂肪和肝脏组织中的高表达表明其可能通过调控脂肪沉积和肝脏代谢，影响水牛肉质的脂肪含量和健康特性。

4 结论

本研究对信阳水牛中的肌纤维转化因子MSTN、BDNF和DKK3基因展开探究，经生物学信息分析，发现MSTN基因编码蛋白质含TGF-β信号通路相关结构域，并且在信阳水牛骨骼肌中高表达，推测其可能调控肌肉细胞的增殖和分化；BDNF基因编码蛋白质含神经营养因子相关结构域，在神经相关组织和骨骼肌中高表达，其可能通过调控神经信号通路和肌肉代谢影响肌肉功能；DKK3基因编码蛋白质含Wnt信号通路相关结构域，在脂肪和肝脏组织中高表达，推测其可能通过调控脂肪沉积和肝脏代谢影响机体健康。这些基因的表达特异性和生物学功能为解析水牛肌肉发育、神经功能及脂肪代谢相关分子机制提供了重要依据，同时也为水牛遗传资源改良提供了潜在的分子标记。未来研究可进一步结合功能实验，验证这些基因在水牛肌肉发育、脂肪代谢等过程中的具体作用机制，为水牛遗传改良和肉质优化奠定坚实基础。

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