【研究意义】随着规模化养殖技术的发展，动物福利设施的应用逐渐成为平衡动物福利与养殖效益的关键抓手。牛体刷作为一种符合牛只天然梳理行为的环境福利设施，对调节牛只生理状态、改善代谢机能具有积极影响[1]。【前人研究进展】以往研究发现，体刷作为一种增加奶牛福利的机械化工具，不仅能够显著提高奶牛的体表清洁度、产奶量和肉牛的采食量、日增重，降低料肉比，还能促进牛只体表血液循环，减少圈养环境下常见的刻板行为[2-3]；同时，使用牛体刷可有效降低牛只皮质醇水平，达到缓解应激的效果[4]。反刍动物体内微生态是维持机体正常生理功能、传递外界干预效应的内在基础系统。除参与能量转化过程外，瘤胃及后肠道内的微生物群落可通过多个信号通路调控宿主生理功能，如瘤胃菌群介导的色氨酸代谢通路转换，有助于调节吲哚-3-乙酸生成量，减轻宿主氧化应激与炎症反应，维持代谢稳态[5]；肠道微生物代谢产物丁酸能促进肠道上皮细胞增殖、增强屏障完整性，减少肠道炎症因子释放[6-7]。与此同时，宿主的代谢状态与生理信号也会通过多重机制反向调控肠道微生物的定植、增殖及功能表达，如结肠段中性偏酸的环境可促进乳酸杆菌等有益菌增殖，实现菌群结构与宿主生理状态的正向适配[8]；宿主早期肠道黏膜TLR2、IL-17A等先天免疫基因的表达可调控菌群结构，引导菌群向功能适应型演替，实现菌群结构与宿主免疫发育的阶段适配[9-10]。因此，解析肠道菌群与宿主代谢的变化规律和互作关系，是连接体刷干预与宿主生产性能变化的关键环节。
【本研究的切入点】目前，针对体刷应用的研究多集中在牛只生产性能指标的变化上，缺乏对肠道菌群组成和血清代谢物变化的研究，这导致该工具在规模化养殖中的精准适配及效能优化难以实现。渤海黑牛是山东省环渤海地区独有的地方黄牛品种，是世界三大黑毛黄牛品种之一，兼具耐粗饲、抗病力强、肉役两用等优良特质[11]。当前，渤海黑牛的集约化养殖以品种资源保护为核心目标，养殖模式侧重于数量维持，对动物福利设施的投入不足，难以充分满足牛只的自然行为需求[12]。地方品种生理代谢特点对外界环境干预更加敏感[13]，福利设施的缺失可能对其健康与生产性能产生较为显著的影响。【拟解决的关键问题】因此，本研究以渤海黑牛为研究对象，通过微生物组学与代谢组学来挖掘体刷对渤海黑牛肠道菌群结构和血清代谢的靶点，以期为搭建动物福利与养殖效益相结合的高效养殖模式提供实践参考。
1 材料与方法
1.1 试验设计与饲养管理
本研究试验动物的饲养管理与样品采集操作，均严格遵循《实验动物 福利伦理审查指南》（GB/T 35892—2018）。试验于2024年9月至2025年4月在山东省棣牛良种繁育有限公司进行。选择月龄一致（12月龄）、体重在(195±6.73) kg、健康状态良好的雄性渤海黑牛18头，分为2组，每组9头，记录每头牛的耳号。对照组（C2）散栏饲养，体刷梳理组（N2）在散栏中安装电动牛体刷（由青岛某公司提供），试验前预试7 d，正式试验180 d，试验期间牛只自由饮水、自由采食，饲料组成相同，饲养管理一致。
1.2 样品采集与测序建库
于试验结束当天饲喂前采集牛只颈静脉血，室温静置3 h后以3000 r/min，离心15 min分离血清，分装后保存于液氮中，后用于非靶向代谢组学检测。肠道微生物通过采集牛只粪便获得，保存于液氮中。采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取总DNA，针对细菌16S rRNA基因V3～V4区进行PCR扩增并纯化后，在Illumina NovaSeq 6000平台上构建PE250双端测序文库。血清的非靶向代谢组学和粪便菌群的16S rRNA测序分析均由上海拜谱生物科技有限公司完成。
1.3 16S rRNA数据处理与分析
原始序列经QIIME2（v.2023.2）处理，Cutadapt去除引物及低质量碱基后，DADA2插件去噪（truncQ=20, maxEE=0.5, chimera.method=consensus）生成ASV表[14]；ASV采用feature-classifier classify-sklearn方法注释，分类器基于SILVA数据库（v.138）训练，朴素贝叶斯算法比对（置信度阈值0.7）[15]；利用QIIME2 diversity插件计算Observed、Shannon、Simpson、Chao1等α多样性指数，并基于Bray-Curtis距离矩阵开展NMDS排序分析。组间差异菌群筛选采用随机森林模型[R软件（v.4.3.1）中的randomForest包（v.4.7-1.2），ntree=500, importance=TRUE][16]；可视化通过R软件（v.4.3.1）中的ggplot2包（v.3.4.2）完成。
1.4 非靶向血清代谢物数据处理与分析
原始数据均经过严格的质量控制（QC）流程，确保分析结果的可靠性。随后，使用MetaboAna-lystR 4.0软件包对数据进行预处理、单变量统计分析以及正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA）。通过变量投影重要性（Variable importance in projection, VIP）分析筛选出显著差异代谢物，并利用KEGG数据库对这些差异代谢物进行功能注释和分类，并通过R软件（v.4.3.1）中的ggplot2（v.3.4.2）包进行可视化。
1.5 血清抗氧化指标检测与分析
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity, T-AOC）及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）的含量与活性使用对应试剂盒进行测定。检测试剂盒全部购自南京建成生物工程研究所有限公司，实验操作过程严格遵循试剂盒说明书规范执行，确保检测结果的准确性与可靠性。血清抗氧化指标数据使用Excel整理，通过GraphPad Prism(v.8.2.0)可视化。
2 结果
2.1 体刷梳理对渤海黑牛肠道菌群结构的影响
本研究共对18个样本进行16S rRNA V3～V4区扩增子测序，最终每个样本得到（42345±5400）条的高质量非单例序列，其中，C2组平均保留（42531±4900）条，N2组平均保留（42190±5800）条，两组测序深度均衡。结果显示，体刷梳理组（N2）的Shannon指数、Simpson指数显著高于对照组（P＜0.05，图1a、1b），Observed物种数（P=0.07）和Chao1指数（P=0.07）与对照组（C2）相比升高但不显著（P＞0.05，图1c、1d）。NMDS分析（图2，Stress=0.137）显示，两组数据微生物群落结构存在显著差异（P=0.002）。在门水平和属水平上，两组数据丰度优势菌组成高度相似，仅在低丰度水平菌落中呈现出一定程度的差异（图3）。属水平聚类热图显示，对照组（C2）与体刷梳理组（N2）的菌属丰度呈现出分别聚类趋势，这可能是驱动组间群落结构的关键（图4）。
图1
图1
渤海黑牛对照组和体刷干预组肠道微生物α多样性的影响
Fig. 1
Effects of Bohai black cattle control group and body brush intervention group on α-diversity of intestinal microorganisms
图2
图2
渤海黑牛对照组和体刷干预组肠道微生物结构差异
Fig. 2
Differences in gut microbial community structure between control and brush-intervention groups of Bohai black cattle
图3
图3
不同组别门水平、属水平肠道菌群堆叠柱状图
Fig. 3
Stacked bar charts of gut microbiota community composition at the genus and phylum levels of different group
图4
图4
属水平丰度热图
Fig. 4
Heatmap of genus-level abundance
2.2 体刷梳理介导的关键差异菌属识别与微生物互作网络分析
图5
图5
渤海黑牛肠道核心菌属的随机森林分析
Fig. 5
Random forest analysis of core gut genera in Bohai black cattle
图6
图6
渤海黑牛肠道菌属微生物共现网络
Fig. 6
Co-occurrence network of gut microbial genera in Bohai black cattle
2.3 血清代谢数据质控与正交偏最小二乘分析（OPLS-DA）
图7
图7
血清代谢组学质控（QC）样本的Pearson相关性分析
Fig. 7
Pearson correlation analysis of quality control （QC） samples for serum metabolomics data
图8
图8
正交偏最小二乘判别分析模型（OPLS-DA）
Fig. 8
Orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） model
2.4 体刷梳理介导下差异代谢物的筛选与分类
利用VIP值和FC值（P＜0.05、VIP≥1、|log₂FC|＞1）筛选出了180个上调代谢物和43个下调代谢物，并通过火山图展示出体刷梳理导致的差异代谢物分布特征（图9）；散点图直观展示出双甲睾酮（Dimethisterone）、油酰乙醇胺（Oleylethanolamide）、瓜叶菊素B（Guayulin B）等代谢物的差异较为显著（图10）。化学结构特征分类结果显示差异代谢物多数属于苯及其取代衍生物（Benzene and substituted derivatives）、二嗪类（Diazines）、羧酸及其衍生物（Carboxylic acids and derivatives）、脂肪酰基类（Fatty acyls）（图11）。样本丰度规律变化热图显示，对照组与体刷梳理组独立聚类，并形成上调与下调两大核心模块。上调的差异代谢物主要为羧酸及其衍生物、脂肪酰基类、苯及其取代衍生物等类别，下调的代谢物主要为部分脂类和杂环化合物（图12）。
图9
图9
差异代谢物火山图分析
Fig. 9
Volcano plot analysis of differential metabolites
图10
图10
代谢物平均强度散点图
Fig. 10
Scatter plot of mean metabolite intensities
图11
图11
差异代谢物类别分布饼图
Fig. 11
Pie chart of differential metabolite class distribution
图12
图12
差异代谢物丰度热图及聚类分析
Fig. 12
Heatmap and clustering analysis of differential metabolite abundances
2.5 体刷梳理介导下渤海黑牛差异代谢物的功能富集与抗氧化验证
差异代谢物通路富集气泡图显示，除抗叶酸耐药性（Antifolate resistance）、氨酰基-tRNA合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis）通路得分接近为0外，其余代谢通路得分都明显为正，表明这些通路在体刷梳理后被激活（图13）。富集气泡图显示，精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）通路、三羧酸循环（TCA cycle）、2-氧代羧酸代谢（2-Oxocarboxylic acid metabolism）通路影响值较高（图14）。同时体刷梳理组中精氨酸生物合成通路的核心产物鸟氨酸（Ornithine）和谷胱甘肽代谢通路的关键中间体焦谷氨酸（Pyroglutamic acid）的相对丰度显著高于对照组（P<0.05，图15），说明精氨酸生物合成通路是体刷梳理影响渤海黑牛氨基酸代谢的关键靶点。血清抗氧化物质检测结果显示，与对照组相比，体刷梳理组的SOD、T-AOC、CAT的活性均显著增强（P＜0.05），GSH-Px和MDA的变化不显著（P＞0.05，图16）。体刷梳理组中与三羧酸循环（TCA cycle）及辅酶合成相关的代谢物琥珀酸（Succinic acid）、延胡索酸（Fumaric acid）、柠檬酸（Citric acid）、琥珀酸半醛（Succinic semialdehyde）、泛酸（Pantothenic acid）、卟啉原（Porphyrinogen）水平均显著高于对照组（P＜0.05）（图17）。
图13
图13
差异代谢物通路富集分析
Fig. 13
Pathway enrichment analysis of differential metabolites
图14
图14
通路影响值气泡图
Fig. 14
Pathway impact bubble plot
图15
图15
关键差异代谢物相对丰度箱线图
Fig. 15
Box plots of relative abundances for key differential metabolites
图16
图16
抗氧化酶及氧化应激指标水平柱状图
Fig. 16
Bar charts of antioxidant enzyme and oxidative stress marker levels
图17
图17
能量代谢通路中代谢物水平柱状图
Fig. 17
Bar chart of metabolite levels in energy metabolic pathways
2.6 体刷梳理介导下肠道核心菌属与血清代谢物的关联特征
三羧酸循环核心代谢物柠檬酸、琥珀酸、富马酸和精氨酸代谢关键中间体瓜氨酸、鸟氨酸呈现出与核心肠道菌属的特异性关联，其中鸟氨酸和瓜氨酸与g_5-7N15菌属呈现出强烈的相关性（Mantel's P＜0.01，图18）；鸟氨酸、瓜氨酸、琥珀酸、柠檬酸、甜菜碱与g_5-7N15菌属呈显著正相关（P≤0.05），同时也与普雷沃氏菌属（g_Prevotella）菌属呈现出相似的变化；甜菜碱、琥珀酸、瓜氨酸与g_Dorea菌属显著负相关（Pearson's r=-0.72、-0.67、-0.63，P≤0.05），并且甜菜碱与g_Coprococcus菌属也显著负相关（Pearson's r=-0.72，P≤0.05）；g_CF231则与多数核心代谢物呈现出中等负相关（图19）。
图18
图18
肠道核心菌属与关键差异代谢物的关联分析网络图
Fig. 18
Correlation network analysis between core gut genera and key differential metabolites
图19
图19
肠道核心菌属与关键差异代谢物相关性热图
Fig. 19
Correlation heatmap between core gut genera and key differential metabolites
3 讨论
3.1 体刷梳理对渤海黑牛肠道菌群结构的影响
肠道是反刍动物营养吸收与免疫防御的重要场所，肠道菌群结构的稳定性对牛只生长发育和稳态维持具有重要意义。本试验发现，体刷梳理下渤海黑牛肠道菌群多样性呈现上升趋势，而菌群多样性是宿主健康的重要标志，菌群多样性的提高通常意味着更强的代谢功能和抗逆能力。方婷婷等[17]研究发现，体刷梳理能够增强牛只免疫力，降低类固醇激素水平。Antwis等[18]研究发现，黑犀牛肠道微生物中多个菌属与糖皮质激素浓度高度相关。阿日查[19]在蒙古牛的试验中发现肠道菌群稳定性与牛只适应性和抗病性紧密相关。结合本研究内容，推测体刷能够通过介导肠道菌群多样性的提高从而增强牛只的抗逆性。此外，NMDS分析（Stress=0.137）呈现的分离趋势和属水平菌群丰度的偏移说明体刷梳理组与对照组间微生物群落结构存在明显差异，进一步印证了体刷对渤海黑牛肠道菌群结构的调控作用。
3.2 体刷梳理影响渤海黑牛肠道菌群中核心菌属的鉴定
随机森林法进一步明确了体刷梳理介导菌群结构变化的关键差异菌属，其中Thermobifida在体刷梳理组中重要程度最高。Thermobifida是典型的纤维降解菌，能够分泌纤维素酶与木聚糖酶，同时能通过共享钴胺素与厚壁菌门等菌群形成互利共生关系，这种共生作用能够进一步促进肠道菌群多样性的提升[20]。Ruminococcus、普雷沃氏菌属、g_Dorea菌属、g_5-7N15菌属等核心菌属位于共现网络中心，而体刷组显著富集的Thermobifida位于网络边缘，与核心菌属关联较弱，这表明体刷干预并未破坏原有核心菌群的互作模式，而是新增了一个相对独立的功能菌模块，进而完善肠道菌群的代谢功能。
3.3 体刷梳理对渤海黑牛血清代谢物的影响
血清代谢组学是反映宿主生理状态的直观技术手段，能够为解析体刷梳理改善渤海黑牛生产性能的代谢机制提供重要线索。本研究中，体刷梳理组抗氧化能力显著提高，鸟氨酸丰度、焦谷氨酸丰度显著升高，二者分别是精氨酸和谷胱甘肽合成的关键前体。大量研究表明精氨酸和焦谷氨酸与宿主抗氧化应激能力密切相关。如赵连文等[21]试验证明精氨酸能够提高肉鸡空肠黏膜超氧化物歧化酶活性，增强宿主抗氧化能力。焦靖娴等[22]发现L-精氨酸能够显著降低脂多糖诱导的小鼠的氧化应激损伤，降低MDA的含量。浩宇[23]研究发现谷胱甘肽能够有效缓解围产期奶牛的氧化应激状态。这与本试验的结果高度一致，表明体刷梳理可能通过激活精氨酸和谷胱甘肽的生物合成提高渤海黑牛的抗氧化能力。此外，能量代谢相关的代谢物在体刷梳理组中也显著高于对照组，这些代谢物的高水平表达进一步揭示了体刷梳理的代谢调控机制。Dong等[24]发现琥珀酸不仅是三羧酸循环中重要的中间物质，还能通过琥珀酸-HIF-1α-IL-1β轴增强宿主免疫。富马酸在多项研究中被证明能够提高饲料利用率[25]。柠檬酸除直接通过三羧酸循环供能外，还被证明能减少多种原因引发的氧化损伤和炎症反应[26]。总的来说，这些差异代谢物在宿主抗氧化应激、能量代谢、生产性能方面有着重要意义。
3.4 体刷梳理通过核心微生物和代谢物的关联特征影响机体抗氧化能力
在本研究中，g_Dorea菌属和g_5-7N15菌属既属于核心肠道菌属，又是随机森林中的高重要性菌属。鸟氨酸、瓜氨酸与g_5-7N15菌属的丰度呈显著正相关，与g_Dorea菌属呈显著负相关。g_5-7N15菌属与反刍动物环境适应性的形成和能量代谢有关[27]，而g_Dorea菌属与反刍动物肠道健康、能量代谢和炎症反应有关。研究表明g_Dorea菌属丰度的降低有利于山羊的炎症缓解和奶牛的代谢改善[28-29]，这与本研究的结果相似。鸟氨酸和瓜氨酸是精氨酸-一氧化氮通路的关键代谢中间产物。而精氨酸-一氧化氮通路的激活能够有效提高大鼠和猪的抗氧化应激能力[30-31]，且肠道菌群结构与精氨酸-一氧化氮通路相关代谢物的生成水平存在双向关联，肠道菌群丰度变化能够影响精氨酸、一氧化氮及其中间代谢物的水平，而补充精氨酸也能够反过来影响反刍动物的肠道菌群结构[32-34]，这进一步说明g_Dorea菌属丰度的降低和鸟氨酸和瓜氨酸水平的提高在改善渤海黑牛抗氧化应激能力中发挥了重要作用。
综上所述，本研究发现体刷梳理能够从多方向改善渤海黑牛肠道菌群结构和代谢水平，其中精氨酸生物合成通路和三羧酸循环通路中的核心代谢物贯穿了整个调控通道。一方面，体刷梳理提高了肠道菌群多样性，同时维持g_Ruminococcus、g_5-7N15、g_Dorea等核心菌群的互作稳态，为机体抗逆性的增强提供了菌群基础；另一方面，属水平高丰度菌属g_Dorea丰度的降低，与鸟氨酸、琥珀酸、瓜氨酸等核心代谢物的升高呈显著的相关性，而这些代谢物不仅是精氨酸-一氧化氮通路和三羧酸循环的关键节点，还能提升精氨酸、谷胱甘肽等物质的合成效率，直接增强宿主抗氧化能力。二者共同构建了体刷梳理调控渤海黑牛抗氧化应激与代谢稳态的内在功能网络。
4 结论
本研究发现，体刷梳理能够提高渤海黑牛肠道菌群的多样性、改善菌群结构，同时显著改变血清代谢物谱，激活精氨酸生物合成和三羧酸循环通路，有效增强渤海黑牛的抗氧化能力，为体刷这一动物福利设施在改善反刍动物健康与福利方面的科学应用提供了新的理论依据。
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