基因组印记是哺乳动物一种重要的表观遗传现象，指特定基因根据其亲本来源不同而呈现出单等位基因表达的现象[1]。基因组印记的建立和维持主要依赖于多种表观遗传修饰的协同作用，例如DNA甲基化与组蛋白修饰、非编码RNA等[2]。目前在人类和小鼠中已鉴定出超过200个印记基因，它们通常成簇分布在基因组某些特定区域，并由印记控制区域统一调控。基因组印记在家畜胎盘形成、胚胎发育、胎儿生长以及出生后代谢调控等生理过程中发挥关键作用。印记异常不仅会导致胎盘功能受损和胚胎发育缺陷，还与肌肉生长、脂肪代谢等多种家畜生长性状等密切相关。研究人员可通过揭示基因表达的父源与母源特异性，进而优化育种策略，提高生产性能，选育出具有优良生长性状和更高肉质的家畜。因此，该簇不仅在胚胎发育及表观遗传调控中具有重要科学价值，同时为动物育种与遗传改良提供理论依据。
DLK1-DIO3印记簇是家畜中较为保守的印记簇，其中DLK1、RTL1等基因主要从父源染色体表达，而GTL2、MEG8等非编码RNA主要从母源染色体表达，该区域基因的表达模式依赖IG-DMR等关键元件精准调控[3]。现有研究表明此基因簇对胚胎发育，尤其是胎盘形成和胚胎血管网络的构建至关重要[4-5]，并且在家畜育种研究中，该基因簇序列变异已被广泛证实与肌肉生长、产奶性能等重要经济性状密切相关，多重调控作用使其成为研究印记遗传与发育调控的经典模型[6]。因此，深入研究DLK1-DIO3印记簇的调控机制并探讨其生物学功能，对开发生物育种新靶点和理解疾病机制具有重要意义。本文综述了该基因簇的研究历史、印记调控模式及其功能，重点总结了该基因簇内DLK1、GTL2、RTL1、DIO3等关键基因，并结合Callipyge（美臀）羊的典型案例，讨论了该基因簇在新品种培育中的应用潜力，系统梳理DLK1-DIO3印记簇在家畜胚胎发育中的功能及调控机制，以期为胚胎发育研究与遗传育种提供理论依据。
1 DLK1-DIO3印记簇研究历史
在哺乳动物基因组中，印记基因通过单等位基因表达调控着胚胎发育、胎盘形成和代谢平衡等关键生物学过程。DLK1-DIO3印记簇位于人类14号染色体和小鼠12号染色体上，其中包含父源表达的基因（如DLK1、RTL1、DIO3）和母源表达的基因（如GTL2和MEG3等）。该基因簇的调控依赖于2个关键的差异甲基化区域（IG-DMR和GTL2-DMR），这些区域负责调控该簇基因的表达。IG-DMR首次由Takada等[7]于2000年描述，研究发现它对DLK1-GTL2区域的印记调控具有重要作用。2011年，Sato等[8]研究揭示了GTL2-DMR在胚胎发育初期对GTL2的印记调控作用。鉴于DLK1-DIO3印记簇在基因表达调控中的重要性，历年来科研人员对簇内各基因进行了详细研究。图1为DLK1-DIO3印记簇模式图。
2 DLK1-DIO3印记簇内印记基因的功能
2.1 DLK1
DLK1作为父源表达的印记基因，在猪出生后仍于骨骼肌、肝脏等组织中维持表达，提示其在出生后生长调控中可能具有长期调控作用[22]。DLK1蛋白属于表皮生长因子（EGF）样蛋白家族，含有6个串联的EGF样重复序列，这些结构域使其能够与Notch受体相互作用，进而调控胚胎发育[23]。在小鼠中，DLK1通过与其他印记基因（如GTL2、MEG3等）相互作用，调节与血管生成相关的Notch信号通路，从而促进胚胎发育和胎盘中的血管形成[4]。DLK1表达失衡会导致胎盘血管发育异常，影响胎儿的营养和氧气供应。除调控血管生成外，DLK1还可通过抑制Notch信号通路来促进神经前体细胞的分化。DLK1通过与Notch受体竞争性结合，阻断Notch配体（如Delta和Jagged）对受体的激活，从而解除对神经分化的抑制[24]。因此，DLK1基因的印记状态对神经系统发育具有重要影响，父源缺失DLK1的家畜胚胎表现出神经发育迟缓、神经元数量减少等表型[25-26]，这表明了DLK1印记表达对神经系统发育的重要性。
2.2 RTL1
在家畜中，RTL1的表达模式与肌肉发育的关键阶段密切相关。在肌肉发育中，RTL1主要通过调控肌卫星细胞的活性和分化发挥作用，RTL1能够通过激活mTOR信号通路促进肌卫星细胞的增殖，同时抑制其过早分化[27]。这种调控机制有利于肌肉的生长发育和损伤修复，对于确保肌肉组织中肌纤维数量的正常建立至关重要。此外，RTL1基因的反义链编码多个miRNA，这些miRNA能够靶向RTL1的mRNA，形成负反馈调控环路[28]。这种双向印记调控机制确保了RTL1表达水平的精确控制，防止其过度表达导致的肌肉发育异常。在著名的callipyge绵羊突变体中，RTL1的异常高表达导致了显著的肌肉肥大表型。这充分说明了RTL1在肌肉发育中的关键作用，也为家畜肌肉性状的遗传改良提供了重要的靶点。
2.3 GTL2
由于GTL2（MEG3）与DLK1在染色体上紧密连锁且呈现相反的印记状态，GTL2能够通过调控DLK1的表达间接影响血管发育。GTL2的表达变化会影响DLK1的表达水平，DLK1通过Notch信号通路进而调控血管生成。GTL2作为母源表达的长链非编码RNA，在家畜胚胎血管系统发育中发挥着独特的调控功能，其母源表达构成了DLK1-DIO3印记簇印记调控网络的重要一环。相关研究表明，GTL2可通过竞争性结合miRNA参与血管发育的调控，GTL2可以与特定miRNA结合后可解除这些miRNA对其靶基因的抑制作用。在家畜胚胎血管发育过程中，GTL2与miR-127、miR-370等多种miRNA相互作用，调控血管内皮生长因子信号通路的活性，对于维持血管稳态和促进血管成熟具有重要意义[29]。在延边黄牛中，lncRNA MEG3的多态性与胸宽、髋宽等多项生长体尺性状存在显著或极显著关联[30]，提示该母源长链RNA不仅参与印记调控，也直接参与肉牛体型生长和肌肉发育。
2.4 DIO3
DIO3在家畜甲状腺激素代谢和内分泌系统发育中发挥着核心作用。DIO3编码III型碘甲状腺原氨酸脱碘酶，该酶是甲状腺激素代谢通路的关键负调控因子，负责将具有生物活性的甲状腺激素T4和T3分别转化为无活性的反T3（rT3）和3,3'-二碘甲状腺原氨酸（T2）[31]。在家畜胚胎发育过程中，DIO3通过在特定组织和特定发育阶段表达，精确调控局部甲状腺激素的浓度，确保胚胎发育的正常进行。在猪胚胎发育研究中，DIO3在肝脏、大脑和胎盘组织中呈现父源表达，其表达水平随妊娠阶段呈现动态变化[32]。即妊娠早期DIO3表达水平较高，有助于降低组织中甲状腺激素浓度，防止过早分化；妊娠中后期DIO3表达适当下调，甲状腺激素发挥促进组织成熟的作用。另有研究发现，DIO3基因敲除的家畜胚胎表现出甲状腺激素水平异常、生长发育迟缓以及神经系统发育缺陷等表型[33]。
3 DLK1-DIO3印记簇的印记调控模式
3.1 IG-DMR区的甲基化调控
IG-DMR是DLK1-DIO3印记簇印记调控的核心区域之一，其甲基化状态直接影响父母源基因的表达差异。近年来的研究发现，IG-DMR区域包含一个由2个功能模块组成的双元件结构，分别在母源和父源染色体上发挥特异性功能，共同保护该位点的甲基化印记免受丢失[1,34]。相关研究表明，在猪和牛等家畜中，IG-DMR区域的甲基化状态变化会直接影响DLK1和DIO3的表达，从而影响胚胎发育和胎盘功能。在克隆猪的研究中发现IG-DMR区域的甲基化丧失导致GTL2基因表达异常，进一步影响DLK1和DIO3基因的表达模式。这些结果表明正确的甲基化状态对于维持家畜DLK1-DIO3印记簇的正常印记状态至关重要。
3.2 DLK1-DIO3印记簇对Callipyge表型的调控作用
Callipyge表型的产生涉及DLK1-DIO3印记簇内多个基因表达水平的协同调控。相关研究发现，在骨骼肌中特异性过表达DLK1的转基因小鼠表现出与Callipyge羊相似的肌肉肥大表型[37]，表明DLK1是诱导Callipyge表型的主要效应因子。RTL1为另一个关键的父源表达基因，其表达模式与肌肉肥大密切相关，然而虽然RTL1在肥大肌肉中表达上调，但其单独过表达不足以诱导肌肉肥大，表明RTL1可能作为DLK1的协同因子发挥作用[38]。母源非编码RNA基因（如MEG3、MEG8等）在携带母源突变等位基因的个体中表达上调[38-39]，这些转录本及其microRNA簇可能通过反式作用调控父源基因表达。例如，MEG8基因内的miR-379/miR-544簇中的miR-329能靶向DLK1 mRNA的3'UTR区域，通过转录后抑制机制调控DLK1蛋白表达[40]。在山羊背最长肌发育过程中，miR-379和miR-544等miRNA的表达呈现发育阶段特异性变化，进一步支持其在肌肉发育中的调控作用[41]。类似地，在肉牛中，microRNAs也被证实是肌肉发育的关键调控因子，影响肌纤维类型、肌肉生长和肉质性状[42-43]。在小鼠中敲除该miRNA簇会导致新生小鼠出现类似Callipyge表型的肌纤维肥大，伴随DLK1表达上调[44]。这揭示了极性超显性遗传的分子机制：父源杂合子中突变等位基因导致DLK1过度表达，而母源miRNA无法完全抑制；母源杂合子或纯合子中，过度表达的母源miRNA有效抑制DLK1表达，避免肥大表型的出现[40]。Callipyge表型调控机制总结见图2。
图2 Callipyge表型调控模式图 Fig. 2 Regulatory model of the Callipyge phenotype |
3.3 不同物种间调控差异
在染色体定位上，猪DLK1-DIO3印记簇位于7号染色体，牛位于21号染色体，羊位于18号染色体远端并与经典Callipyge位点共同定位。在调控方面，该簇表观遗传稳定性存在显著物种与品种差异：猪IG-DMR在体细胞核移植时易发生异常高甲基化，导致MEG3下调及DLK1/RTL1异常激活，与生长迟缓和代谢异常密切相关[47]；牛DLK1-DIO3印记簇域结构与人、小鼠高度共线，多级体细胞DMR及增强子与启动子之间相互作用，共同保障胚胎发育过程中相对稳定的印记状态[1]；羊则在DLK1-GTL2间顺式元件上形成Callipyge突变，产生极性超显性，仅父源杂合个体表现显著后躯肌肉肥大[48]。综合来看，猪中常表现为印记异常，与生长脂肪性状紧密相关；牛印记相对稳定更偏向繁殖和胎盘功能；羊则以单点位突变产生特殊性状，凸显物种和品种特异性。
4 DLK1-DIO3印记簇内的印记基因与家畜胎盘发育
4.1 DLK1-DIO3印记簇在家畜胎盘发育中的作用
胎盘作为连接母体与胎儿的关键器官，其发育过程涉及复杂的血管形成与营养转运调控。DLK1-DIO3印记簇，通过父源表达的蛋白编码基因（DLK1、RTL1、DIO3）与母源表达的长链非编码RNA（GTL2、MEG8等）之间的精密平衡，在家畜胎盘形态建成与功能成熟中发挥多层次调控作用。
在胎盘血管发育方面，DLK1-DIO3印记簇成员通过调控关键信号通路实现协同作用。父源表达的DLK1通过双重机制促进血管生成：一方面作为Notch信号通路的抑制因子，DLK1阻断Notch受体激活，解除其对血管分支的抑制效应，促进家畜胎盘绒毛膜血管网络密集化。母源表达的GTL2通过招募PRC2复合物介导H3K27me3修饰，抑制血管生成相关基因转录，防止血管过度分支。在猪胎盘发育中，GTL2呈现动态表达特征：妊娠早期低表达利于血管快速建立，中期表达上调促进血管成熟，后期表达至高峰以维持血管稳态[47]。在小鼠模型中，抑制母源表达的GTL2基因会导致父源表达基因（如DLK1、RTL1等）异常激活，进而引起胎盘血管发育缺陷和围产期死亡，进一步证实了GTL2在维持印记基因表达平衡和胎盘功能中的关键作用。此外，在羊胎盘中RTL1基因对促进胎盘血管生成和胎儿毛细血管维持方面至关重要，其表达水平受到miR-127的严格调控，miR-127异常表达会导致RTL1剂量失衡，进而引起胎盘血管系统破坏和功能障碍，最终导致胎儿死亡[49]。
在营养转运调控层面，DLK1-DIO3印记簇通过父源与母源等位基因的拮抗性表达调控家畜胎盘功能。羊胎盘发育中，III型脱碘酶DIO3通过调控局部甲状腺激素代谢影响胎盘营养转运功能；母体营养供应不足会导致小胎龄羊胎盘中DIO3蛋白含量降低，DIO2/DIO3比值升高，破坏了T3/rT3代谢平衡，进而干扰甲状腺激素受体THRA及下游营养转运相关蛋白的表达[50]。这些研究揭示了DLK1-DIO3印记簇在调控家畜胎盘营养转运中的核心作用。
4.2 DLK1-DIO3印记簇印记异常与家畜胎盘发育障碍
DLK1-DIO3印记簇的印记状态对胎盘发育具有决定性影响。在家畜克隆技术中，DLK1-DIO3印记簇的异常印记是导致克隆效率低下的重要原因之一。猪体细胞核移植中，IG-DMR发生异常高甲基化，母源GTL2几乎沉默，父源DLK1与DIO3过度激活，这种表达失衡导致胎盘血管发育异常、营养转运功能紊乱，最终引起胎儿生长受限甚至死亡[47]。该现象与胚胎发育阻滞、围产期死亡率升高及弱仔、断奶体重下降密切相关，已成为限制克隆猪生殖性能的重要表观遗传因素。在牛体外胚胎生产获得的大型后代综合征（Large offspring syndrome，LOS）个体中，包括DLK1-DIO3印记簇在内的印记位点普遍出现甲基化紊乱及母源GTL2相关DMR低甲基化，伴随胎儿过度生长、流产、难产及围产期死亡风险增高[51]。小鼠模型进一步表明，IG-DMR关键序列缺失或母源RNA转录丢失可导致胎盘血管异常和围产期致死，为印记异常引起流产和生长受限提供了直接证据[52]。因此，在家畜辅助生殖和育种实践中研究DLK1-DIO3印记簇的印记状态，可用于胚胎质量评估和高风险妊娠预警，对降低流产率和改善生长性能具有潜在应用价值。
5 结语
DLK1-DIO3印记簇维持了父母来源基因表达的平衡，在家畜胎儿与胎盘生长发育中发挥重要调控功能。当前DLK1-DIO3印记簇研究仍存在多方面空白与争议：例如，不同物种和组织中IG-DMR及母源lncRNA对印记维持的精确层级关系尚不清晰[53]；CRISPR-dCas9等表观编辑手段[54]虽已用于精确定义IG-DMR核心CpG并稳定DLK1-DIO3印记簇的印记[42,55]，但在大动物胚胎与家畜生产中仍存在脱靶风险，其跨代稳定性和性状一致性仍缺乏系统评估。鉴于家畜胎盘类型的不同，未来研究可围绕家畜中DLK1-DIO3印记簇的具体调控模式展开，深入解析该基因簇中非编码RNA尤其是miRNAs的具体靶基因和调控网络，重点研究胎盘血管结构形成、滋养层细胞分化以及胚胎早期表观遗传重编程等关键过程。后续工作还可在牛、猪、羊等物种中验证簇内长链非编码RNA和miRNA簇对胎盘与胚胎相互作用、能量代谢和胚胎生长模式的影响。基于这些认识可为提升家畜繁殖效率、改善生长性状，以及为生物育种提供靶标[56]。
