胚胎冷冻保存技术是指通过程序化降温和冷冻保护剂，使胚胎的生命活动处于停滞状态，以实现长期保存，并在解冻后能恢复活力的一种核心保种技术。该技术作为长期稳定保存遗传资源的核心手段，在动物优良种质高效利用、种质资源保护、遗传基因库构建以及生物多样性保护等领域具有不可替代的重要作用。而且冷冻保存的胚胎便于远距离运输，不仅降低了进出口的费用，而且能最大限度减少疾病传播的风险。通过胚胎冷冻保存技术不仅能够长久保存珍稀、濒危动物品种和优良生产性能家畜的遗传资源[1-2]，而且该技术还可以作为关键技术促进动物遗传资源的鉴定、挖掘以及高效利用等工作的开展[3]。
1 猪胚胎常规冷冻保存技术
哺乳动物胚胎冷冻保存技术最先使用的方法是缓慢冷冻法。缓慢冷冻是指采用低浓度冷冻保护剂对细胞或胚胎进行梯度脱水，在程序冷冻仪中缓慢降温至植冰（指在略低于水溶液正常冰点的温度下诱导冰晶形成，以防止超冷现象，阻止核冰晶形成）后，继续降温至-30 ℃到-80 ℃后液氮保存。20世纪70年代，Whittingham等[8]开发的常规程序化冷冻方法先后成功应用到牛、羊、马以及人类等多个物种的胚胎冷冻保存。
猪胚胎对低温极为敏感，当环境温度低于15 ℃时便易发生不可逆的生理损伤。因此，常规的胚胎冷冻技术在直接应用于猪胚胎时，保存效果欠佳。在生理特性方面，猪胚胎中脂质的含量显著高于牛、绵羊、小鼠等动物。研究表明，猪胚胎对低温的敏感性与其富含脂质密切相关[1,7]。脂质在胚胎冷冻过程中会经历从液态到凝胶态的不可逆相变，直接导致细胞膜流动性丧失、膜蛋白功能失调及生物膜系统损伤。其次，脂质滴在胚胎冷冻过程中的相变会产生巨大的物理机械应力，挤压并破坏脆弱的细胞器及细胞骨架系统。最后，脂质还会在冷冻胚胎复温过程中诱发氧化应激，产生活性氧攻击线粒体DNA和胚胎结构蛋白，引起胚胎大规模凋亡。因此，猪胚胎中的脂质不仅是物理层面的损伤源，更是分子层面干预胚胎氧化平衡与发育潜力的重要障碍。
Nagashima等[9]提出通过离心法和显微操作去除胚胎中部分脂质，进而改善猪胚胎冷冻耐受性。具体而言，在冷冻前先对早期胚胎进行离心处理，使胞内脂质聚集于胚胎一侧，随后借助显微操作去除聚集的脂滴，再进行程序化冷冻。该方法显著提升了2-细胞至8-细胞期猪胚胎的低温耐受能力，并成功实现了常规冷冻保存。然而，尽管猪胚胎常规冷冻保存技术取得一定进展，经该方法保存的猪胚胎在移植后的成活率仍极低，限制了其在实际生产中的推广应用。
2 猪胚胎玻璃化冷冻技术
与常规冷冻方法相比，玻璃化冷冻技术具有以下优点：①玻璃化冷冻技术显著减少了对细胞或者胚胎的损伤；②玻璃化冷冻胚胎解冻后存活率更高（表1）；③玻璃化冷冻技术不需要专门的缓慢冷冻设备，从而节省了设备购置及维护成本[10,15]。猪胚胎玻璃化冷冻技术开始于上世纪90年代，并逐步进行改良[16]。20世纪90年代，多个团队先后证实了该技术在猪胚胎保存中的可行性[17]。随后，Vajta等[18]开发了具有突破性的开放式拉长细管（Open pulled straw，OPS）玻璃化冷冻法（表1）。该技术的核心在于将0.25 mL的冷冻细管加热拉长，使其外径与内径均缩小至原尺寸的约一半。细管的超薄管壁极大地提高了热传导效率，使胚胎能快速通过冰晶形成的危险温度区，从而有效减少低温损伤。同时细管内部体积的缩小降低了冷冻保护剂的用量，进而减轻了其潜在的细胞毒性效应（表2）。OPS技术的有效性很快在猪胚胎冷冻中得到验证。Berthelot等[19]人应用此方法成功冷冻保存了猪的胚胎，并获得了活产仔猪，随后他们进一步证明该技术同样适用于完整致密桑椹胚的冷冻[20]。Cuello团队[21-22]在OPS技术基础上开发了改进方法：超细开放式拉长细管冷冻技术（Superfine open pulled straw, SOPS，表2）以及与之配套的Vit-Master-SOPS玻璃化快速冷冻仪。Cameron和Beeb等[23-24]则分别通过结合脂质离心技术和OPS玻璃化冷冻技术，将猪早期和孵化囊胚期冷冻胚胎的存活率进一步提高。
表1 猪胚胎的冷冻效果比较Table 1 The survival rate of different cryopreservation methods on pig embryos |
表2 常用胚胎玻璃化冷冻技术方案汇总Table 2 Summary of embryo cryopreservation methods |
| 技术方案Methods | 冷冻保护剂 Cryoprotective agent | 操作步骤 Operation | 参考文献 References |
|---|---|---|---|
| OPS | 冷冻液1：TCM199+20% FBS+ 7.5% EG+7.5% DMSO 冷冻液2：TCM199+20% FBS + 18% EG + 18% DMSO + 0.6 M 蔗糖 | （1）将收集到的体内或体外胚胎在TCM199+20% FBS液中清洗 （2）胚胎首先在冷冻液1中处理3 min （3）将胚胎转入冷冻液2中 （4）在转入冷冻液2后的30 s内，将2～6枚胚胎吸入OPS管末端 （5）直接将OPS管插入液氮中保存 | [18] |
| SOPS | 冷冻液1：TCM199 HEPES+20% FBS +7.5% DMSO +7.5% EG 冷冻液2：TCM199 HEPES+20% FBS + 16% DMSO +16% EG+ 0.4 M 蔗糖 | （1）将5～7枚胚胎置于冷冻液1中平衡3 min （2）将胚胎转移至冷冻液2中处理1 min （3）将胚胎置于小于1 μL 的冷冻液2液滴中，利用毛细作用装入SOPS细管 （4）立即将装有胚胎的细管水平插入液氮中 | [21-22] |
| Cryotop | 冷冻液1：TCM199+20% FBS + 10% EG + 10% DMSO 冷冻液2：TCM199+20% FBS + 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M 蔗糖 | （1）将胚胎放入冷冻液1处理30 s （2）转入冷冻液2处理20 s （3）使用极细的拉细玻璃管将胚胎吸出，以“点样”方式将胚胎和极少量的保护液（<0.1 μL）放置在Cryotop尼龙条的顶端 （4）迅速将尼龙条端直接浸入液氮中 （5）在液氮液面下为Cryotop套上专用的塑料保护外套，防止液氮流动引起胚胎脱落或污染 | [37-40] |
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在胚胎冷冻、解冻以及胚胎移植过程中，维持胚胎透明带的完整性并确保操作过程的无菌状态，对于防止微生物污染、提升技术稳定性以及保障生物安全至关重要。然而，机械离心脱脂法需要穿刺透明带以移除脂质，本质上破坏了胚胎的天然物理屏障，增加了污染风险。同样，常规的玻璃化冷冻方案中，胚胎与可能含有细菌和真菌的液氮直接接触，也构成了显著的生物安全隐患，有研究表明液氮中含有多种细菌和真菌[25]。为应对上述挑战，一系列非侵入性与无菌化技术先后涌现。首先，在胚胎脱脂新方法上，Li等[26]提出了一种无需穿刺透明带的策略：通过酶处理或高渗溶液扩大卵周间隙后进行离心，促使脂质滴与细胞质分离并被截留于完整的透明带内。该方法在有效降低胚胎低温敏感性的同时，完美地保全了透明带的完整性。而在冷冻保存的无菌化方面，Beebe等[27]开发的不与液氮接触的低温玻璃化方法（Cryologic vitrification method, CVM），在猪囊胚上取得了94%的解冻存活率。Misumi等[28]开发了微风量空气冷冻法（Micro volume air cooling, MVAC）的特殊设备，同样避免了与液氮的直接接触，而且冷冻胚胎达到88.9%的高存活率。Arav等[29]开发了一种能产生与液氮温度相近的洁净液态空气的装置，以及一种能在常规液氮罐中保持样本密封的无菌存储罐装置，从根本上解决了交叉污染问题。这些技术的建立为高效、安全的胚胎生物工程应用奠定了坚实基础（图1）。
3 猪胚胎玻璃化冷冻技术的研究方向
3.1 冷冻保护剂及培养基的优化
在胚胎冷冻保存技术中，冷冻保护剂扮演着至关重要的角色，其核心功能在于通过置换细胞内水分，抑制破坏性冰晶的形成，从而保护细胞在超低温环境下的结构完整性。传统上，冷冻保护剂分为两大类：一类是能够穿透细胞膜的渗透性冷冻保护剂，如乙二醇、二甲基亚砜、丙二醇、甘油等，它们通过直接进入细胞内部实现深度脱水以促进玻璃化；另一类是停留在细胞外的非渗透性冷冻保护剂，如蔗糖、葡萄糖、聚乙烯醇等[1-2,8]，它们通过提高胞外渗透压间接使细胞脱水，并稳定细胞膜。研究表明，这两类冷冻保护剂对猪囊胚保存的作用效果无显著性差异[30]。另外，胚胎的发育阶段会影响其对冷冻保护剂的渗透性，猪扩张期囊胚对乙二醇和甘油的渗透性高于早期胚胎，因此低温耐受性最好，扩张期囊胚冷冻保存后的存活率最高[31]。
然而，高浓度的冷冻保护剂普遍存在细胞毒性，这一固有缺陷限制了其应用潜能。尽管有研究指出，在特定条件下适当降低冷冻保护剂浓度并不会牺牲冷冻效果[32]，但关于冷冻保护剂浓度、作用时间与胚胎发育阶段之间的精准调控机制仍有待阐明。此外，新型冷冻保护剂的研发也是猪胚胎冷冻保存技术中的重点内容[7]。以鱼抗冻蛋白（Antifreeze glycopeptides, AFGPs）为代表的生物分子，能够主动抑制冰晶的结晶与生长，显著提升细胞存活率。其次，人工合成的生物聚合物[33]，如羧化ε-聚-L-赖氨酸（Carboxylated ε-poly-L-lysine, COOH-PLL）[1,33-34]，具有无毒且能高效抑制冰重结晶活性，已成功用于胚胎冷冻并产下健康后代[34]。此外，研究发现，将抗氧化剂（如虾青素）作为辅助成分添加至培养体系，能够有效缓解冷冻-复苏过程所诱发的氧化应激损伤，从而显著改善胚胎的后续发育能力[35]。这些新进展标志着胚胎冷冻技术正从单纯依赖传统冷冻保护剂，迈向一个结合了生物仿生学与细胞代谢调控的多元化、精细化的新阶段。
3.2 玻璃化冷冻流程的优化
为将冷冻体积极限压缩，研究人员开发了一系列精密的载体工具。其中，以Cryoloop[36]及后续改良的Cryotop[7,37-40]为代表的薄膜技术尤为突出（表2-3）。这些工具利用表面张力将胚胎置于一层约0.1微升的超薄液膜中进行冷冻，极大地提升了降温效率。该方法已在猪孤雌激活胚胎和克隆胚胎中得到成功验证，并进一步衍生出能够同时处理多个胚胎的系统，展现了其向高通量应用方向发展的巨大潜力[40]。与此类似，中空纤维玻璃化（Hollow fiber vitrification, HFV）和可溶性普鲁兰多糖膜等技术[41]也分别通过微型管道和可降解薄膜实现了微量化冷冻，并在简化玻璃化冷冻操作流程、提高解冻后发育率方面取得了显著成果。
表3 不同玻璃化冷冻载体性能对比表Table 3 Comparison of different vitrification carrier |
除微量化外，另一条技术路径是利用高导热率材料来加速热传递。固体表面玻璃化（Solid surface vitrification，SSV）即通过将胚胎与预冷至-150 ℃的金属板接触来实现快速降温。有研究对比发现，金属网载体（Metal mesh vitrification，MMV）优于塑料板玻璃化法（Plastic plate vitrification，PPV），从而显著提高了猪扩张期囊胚的存活率[42]。
3.3 通过高通量测序技术解析玻璃化冷冻对胚胎的影响
深入解析胚胎在玻璃化冷冻过程中的基因、蛋白质表达以及代谢产物的变化，不仅可以揭示低温损伤的分子机制，还可为优化冷冻方案、发掘潜在生物标志物提供关键依据。高通量测序技术的应用正在将这一研究推向系统性和全局性的新高度[45-48]。早期的研究多采用定量PCR技术，其结果揭示了冷冻过程能够引起特定基因表达的扰动。随着转录组及蛋白质组等高通量组学技术的成熟，相关研究进入了一个全新的阶段。全景式转录组测序分析提供了更为全面的数据。部分研究指出，玻璃化操作本身对转录组的影响可能较小[49-50]。Jia等[51]对猪卵母细胞的高通量转录组测序分析表明，玻璃化冷冻处理的猪卵母细胞中有19个上调基因和18个下调基因。Zhang等[52]对猪的克隆胚胎进行单细胞转录组测序分析发现，玻璃化冷冻降低了猪克隆囊胚的存活率，并导致540个基因的表达改变。Xiang等[53]对玻璃化冷冻保存的2-细胞、4细胞和囊胚阶段的猪克隆胚胎进行了转录组测序，提供了关于不同发育阶段玻璃化猪克隆胚胎的mRNAs和长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNAs）的综合转录组数据，有助于进一步了解胚胎发育受损的潜在低温损伤机制。Almiñana等[54]通过转录组测序揭示了玻璃化冷冻特异性的基因表达变化。这些研究为构建低温损伤的调控网络提供了宝贵资源。
在蛋白质层面，基于串联质量标签（Tandem mass tag, TMT）标记的定量蛋白质组学分析进一步证实，玻璃化冷冻会显著改变细胞的蛋白质表达谱。例如，Jia等[55]使用基于TMT的定量蛋白质组学方法，分析玻璃化保存的猪未成熟卵母细胞体外成熟培养后的卵丘细胞的蛋白质表达谱。该研究共确定了5910个蛋白质，其中88个有明显的差异，46个上调的蛋白质和42个下调的蛋白质。富集分析显示，细胞周期相变、有丝分裂细胞周期相变、细胞分化调节等生物过程明显下调。这一结果为理解玻璃化如何导致胚胎发育质量下降提供了直接的分子证据。综上所述，从靶向分析到系统组学的研究范式转变为我们揭示低温损伤的深层机制开辟了新路径，并为未来开发更优化的胚胎冷冻保存策略奠定了坚实的理论基础。
4 结语
猪胚胎冷冻保存技术经过七十多年的不断发展，取得了许多显著的进步。但是冷冻胚胎的解冻存活率以及后续发育潜能仍然与新鲜胚胎存在较大的差距，而且猪胚胎冷冻技术的产业化仍面临稳定性与成本的双重考验。一方面目前的冷冻操作依赖熟练技术人员的经验，难以满足商业化胚胎移植的通量需求。另一方面胚胎冷冻、复苏和培养的成本还需要进一步降低，以适应商业化、规模化应用的需求。
随着研究人员对猪卵母细胞分子结构、胚胎发育机制的深入解析，以及生物物理学、新材料、人工智能（Artificial intelligence, AI）辅助设计等技术的持续革新，进一步提高猪冷冻胚胎发育效率终会成为可能。例如利用AI辅助建立胚胎渗透动力学模型，精准预测临界降温或者回温速率，实现针对不同品种和发育阶段猪胚胎个性化冷冻流程。其次，新型抗冻蛋白及其模拟物的发掘和筛选也是提高猪冷冻胚胎发育效率的一个重要研究方向。未来，通过代谢重编程技术或者分子干预降低胚胎胞内脂质含量、开发新型高热传导效率介质或方法、开发新型冷冻保护剂、研制解冻后线粒体功能修复方法、建立胚胎冷冻自动化装载技术或设备，有望将猪冷冻胚胎的发育能力进一步提升至接近新鲜胚胎的水平。这不仅将彻底改变生猪种质资源的全球化流转模式，也为保护地方猪遗传多样性和构建生物医学模型猪种质库奠定坚实的科技基石。
